刺客教條影以日本戰國為背景，敵人也參照了戰國時代粉墨登場地各類經典角色，例如武士、忍者、僧兵、浪人等。主角彌助為武士，奈緒江則是忍者。
足輕
足輕通常會在高軍階敵人的指令下行動。
他們可以在戰鬥中承擔各種職責，例如遠距離攻擊、用刀劍長矛近距離交戰、在處於戒備狀態時調查可疑區域等等。
他們的戰鬥連擊較短，防禦手段也十分有限，卻是敵軍部隊中數量最多的存在。
武士
武士是久經沙場的戰鬥專家，隨時可以投入戰鬥。
大多數武士都會穿著重型盔甲，使用招架、躲閃、格擋等手段阻止你的前進。
這種敵人還會使用威力強大的連擊，相當難以對付。
僧兵
僧兵是靈敏且頑強的戰士，可以在戰鬥中治療自己。
他們能夠使用各種不同尋常的遠程與近戰武器（如雙刀等），還會抓住時機進行躲閃，以求獲得優勢。
僧兵起疑時會展開調查，因此在他們周圍一定要謹慎行事
土匪
為了擊敗敵人，這種魯莽無謀的土匪敵人無所不用其極。
土匪經常投鄭石塊，或赤手空拳進行打擊，戰法毫無榮譽可言。
這類敵人中有不入流的小流氓，也有行蹤詭秘的盜匪，經常在小型營地和各類被占據的城池中出現。
對付他們時，可以考慮使用煙霧彈創造機會。
浪人
這些武士不奉任何人為主。作為敵人，他們聰明且善於分析，經常在道路附近出沒。
在與浪人的戰鬥中，如果進攻過於輕率，就會被迅速格擋，並遭到難纏的反擊。
他們很少穿著盔甲，但往往攜帶著相當珍貴的戰利品。
忍者
忍者精於隱行動與暗中破壞，活躍在日本的各個角落一一隻不過，他們通常會躲藏起來，或使用各種各樣的偽裝。
戰鬥中，他們的身手與頭腦同樣靈活，雖然不像其他戰士那樣驍勇好鬥，但會使用各種武器和道具（如短刀、苦無或鎖鐮）來扭轉戰局，占領上風。他們往往會利用煙霧彈和投擲武器，完成自己唯一的任務：消滅彌助和奈緒江。
